Nadekspresja cytokiny BAFF i ryzyka autoimmunologicznego ad 7

Poziom istotności, obliczany za pomocą testu t, jest wskazany. Dane transkryptomu implikują także BAFF-var jako locus cechy ilościowej ekspresji, która zwiększa ekspresję TNFSF13B (P = 2,37 x 10-13) (Figura 1F). Jednak podwyższony poziom mRNA mógłby wyjaśniać tylko 24 do 27% wpływu na poziomy białka (rozpuszczalny BAFF) (Figura 3A i sekcja Wyniki w dodatkowym dodatku), wskazując, że prawdopodobnie chodziło również o zwiększenie poziomu translacji. Wyższe poziomy białka BAFF-var mogą być spowodowane obecnością miejsc miRNA w dłuższym, ale nie w krótszym, 3 UTR, który może zmniejszyć produkcję białka z dłuższego 3 UTR.21
Zidentyfikowaliśmy miejsca miRNA należące do Silico, które nie występowały w skróconym 3 -UTR (Tabela S4 w dodatkowym dodatku) i testowano je przez wyciąganie kompleksów miRNA-mRNA z lizatów THP1 przy użyciu sond biotynylowanych RNA dla TNFSF13B typu dzikiego 3 UTR i wariant 3 UTR (ryc. S5A w dodatkowym dodatku). MiRNA w rodzinie miR-15/10722 i miR-494 były bardziej wzbogacone w sondę dla 3 UTR typu dzikiego niż w przypadku wariantu 3 UTR (ryc. S5B w dodatkowym dodatku), co sugeruje ich preferencyjny charakter. interakcja z dłuższym 3 UTR.
Potwierdzając ich hamujący wpływ na ekspresję BAFF, nadekspresję miR-15a, miR-497 i miR-646, ale nie miR-16 i miR-494, znacząco obniżone poziomy endogennego białka BAFF w komórkach THP1 (Figura 3B i 3C ). Jeden z tych miRNA, miR-15a, ulega silnej ekspresji w pierwotnych monocytach (Figura 3D), a zatem został użyty w dalszych eksperymentach walidacyjnych; jego nadekspresja nie obniżała poziomów endogennego mRNA TNFSF13B (Figura 3E), zgodnego z potranskrypcyjną regulacją wytwarzania białka BAFF. Dalsze wspieranie regulacji poziomów białka BAFF, supresji miR-15a przy użyciu zablokowanego kwasu nukleinowego-anty-miR zwiększyło wytwarzanie rozpuszczalnego BAFF, zarówno w komórkach THP1, jak iw pierwotnych monocytach (Figura 3F i 3G).
Figura 4. Figura 4. Regulacja różnicowa ekspresji BAFF przez miR-15a.Panel A pokazuje reprezentację konstruktów reporterowych lucyferazy. Komórki BAFF 3 UTR typu dzikiego (WT) i wariant (var) sekwencje UTR BAFF 3 klonowano do wektora pmirGLO. Liczby i 2 odpowiadają miejscu wiązania miR-15a. Panel B pokazuje kotransfekcję konstruktów reporterowych BAFF (WT lub var) z prekursorem miRNA-15a lub kontrolą ujemną w komórkach HeLa. Mut. i Mut. 2 odnoszą się do reporterów zmutowanych w pierwszym i drugim miejscu wiążącym miRNA-15a przedstawionym w panelu A. Poziomy lucyferazy Firefly normalizowano do aktywności lucyferazy renilla dla każdej próbki i wszystkie wartości wykreślono względem konstruktu WT. Wykres jest reprezentatywny dla czterech niezależnych eksperymentów. Poziom istotności, obliczany za pomocą testu t, jest wskazany.
Aby zweryfikować, że miR-15a bezpośrednio jest skierowany przeciwko TNFSF13B, sklonowaliśmy dzikiego typu BAFF 3 UTR i wariant BAFF 3 UTR do wektora reporterowego pmirGLO (Figura 4A) i analizowaliśmy aktywność lucyferazy w komórkach HeLa, które wyrażają niskie poziomy miR. -15a (ryc. S6 w dodatku uzupełniającym). Kotransfekcja miR-15a z miano BAFF 3 UTR typu pmirGLO lub wariantem UTR BAF 3 z pmirGLO znacznie zmniejszyła poziomy reporterowe, podczas gdy reportery niosące zmutowane miejsca wiązania miR-15a były oporne na represję przez miR-15a (Figura 4B).
Co ważne, kotransfekcja miR-15a z wariantem BAFF 3 UTR zmniejszyła aktywność reportera do poziomów podobnych do obserwowanych dla UTR typu dzikiego BAFF 3 z jednym z dwóch miejsc zmutowanych miR-15a, prawdopodobnie z powodu jednego miejsca miR-15a. nie występuje w wariancie BAFF 3 UTR
[przypisy: ośrodki terapii uzależnień nfz, cena badania moczu, za mało neutrocytów ]

Powiązane tematy z artykułem: cena badania moczu ośrodki terapii uzależnień nfz za mało neutrocytów